Centro de informação sobre biotecnologia e biossegurança – engenharia genética para utensílios de artrite de soja com treonina alta

Para alimentar esta grande população, a produção anual de cereais precisaria ser de cerca de 3 bilhões de toneladas em 2050, acima dos 2,1 bilhões de hoje, e a produção anual de carne precisará aumentar em mais de 200 milhões de toneladas para 470 milhões de toneladas1. . À medida que enfrentamos a pressão desse crescimento populacional contínuo e da limitação dos recursos agrícolas, reconhecemos que o desafio não é apenas atender aos requisitos futuros da alimentação humana e animal, mas também atender à necessidade de culturas e alimentos nutricionalmente equilibrados.

EAA) estão bem documentados2. Melhorar os EAAs ou o conteúdo de proteína nutricional nas principais culturas de grãos terá um impacto social e econômico significativo em todo o mundo, especialmente nos países em desenvolvimento, onde a demanda calórica é mais provavelmente satisfeita à custa da nutrição equilibrada de aminoácidos.

As principais culturas são deficientes em um ou mais EAAs para alimentação humana e animal. Essas deficiências incluem Lys e Trp em milho3, Met e Thr em soja4, Met, Cys e Ile em batata5, e Lys e Thr em arroz6. Portanto, os EAA sintetizados quimicamente ou microbialmente são rotineiramente usados ​​como suplementos para dietas baseadas em grãos e outros animais, resultando em aumento do custo dessas dietas. Uma abordagem alternativa – cultivar geneticamente culturas com EAAs reforçados / balanceados – pode oferecer um sistema mais eficiente e sustentável para dietas de animais nutricionalmente equilibradas.

Porque Thr, Lys, Met osteoartrite joelho alívio da dor, e Ile são os principais EAAs limitantes nas culturas, e todos são produzidos a partir de aspartato em plantas através de uma via ramificada (Fig. 1), o caminho da família aspartato tem recebido crescente interesse na planta molecular biologia e biotecnologia. Uma compreensão melhorada da biossíntese de aminoácidos essenciais de plantas agora possibilita a engenharia metabólica do aumento do conteúdo de EAA usando abordagens de melhoramento de plantas e de biotecnologia.

Entre as diferentes estratégias usadas até hoje, três principais foram usadas para aumentar os níveis de EAAs livres ou armazenadas de proteína nas culturas: melhoramento convencional de plantas; seleção genética de mutantes com alto EAA; e biotecnologia. Até o momento, os exercícios para artrite na região lombar e nos quadris com sucesso nas abordagens de reprodução e seleção de mutantes têm se restringido principalmente ao desenvolvimento do milho com alto teor de lisina através da identificação da variação / mutação natural3. Este esforço foi dificultado por características agronómicas indesejáveis ​​associadas à mutação. A falta de recursos genéticos naturais para o melhoramento de plantas é a principal responsável pelo sucesso relativamente limitado no aumento de EAAs para outras espécies de culturas.

Em contraste, a engenharia genética oferece uma oportunidade mais promissora para melhorar a qualidade nutricional das sementes. Avanços recentes em genômica e biotecnologia fornecem uma maneira eficiente e direta de marcar os genes de interesse e subsequentemente desenvolver marcadores moleculares para acelerar a incorporação de genes alvo em germoplasmas de elite. Em particular, a biotecnologia pode utilizar promotores específicos de sementes para dirigir a expressão específica de características desejadas de interesse, assim corrigindo eficientemente características indesejáveis ​​associadas com quantidades elevadas de um aminoácido específico. Exemplos bem-sucedidos de culturas biotecnológicas com características de qualidade melhoradas incluem milho LY038 de alta concentração (primeira cultura comercial biotecnológica com alto valor nutricional), soja com alto teor de Trish7 e artrose com alta taxa de Trp significando soja8.

Com os avanços científicos na genômica, várias abordagens de biotecnologia foram tentadas para melhorar os níveis de EAAs em cultivos alimentares8, 9. Três estratégias se destacam, a saber: 1) aumentar o pool de EAA livre através da engenharia genética do metabolismo de EAA; 2) aumentar a qualidade nutricional das proteínas com o perfil de EAA apropriado, alterando os níveis de proteínas naturais ricas em EAA e / ou a expressão de genes sintéticos que codificam proteínas ricas em EAA; e 3) aumentar os EAAs livres e ligados a proteínas nas culturas. Aumentar os EAAs livres e aumentar o acúmulo de proteína rico em EAA simultaneamente ofereceria a vantagem de reduzir os efeitos potencialmente negativos causados ​​por altas concentrações de um aminoácido livre ou fluxo desequilibrado nas vias biossintéticas de aminoácidos.

A treonina (Thr) é um dos vários aminoácidos essenciais limitantes, e seu nível nas rações pode impactar a produção de importantes fontes de carne, como suínos e aves. Como mostrado na Figura 1, o aspartato forma todo o esqueleto de carbono para Thr através de um caminho primário, onde os ramos secundários na via permitem a síntese de Lys e Met. A primeira enzima na via, a aspartato quinase (AK, EC 2.7.2.4), catalisa a fosforilação dependente de ATP do aspartato em fosfato de β-aspartil. AK é o principal passo regulamentar cobre as opiniões de luvas de artrite de mãos controlando o fluxo metabólico através do caminho.

Para elevar os níveis de Thr em sementes de soja, mantendo a germinação normal das sementes, identificamos e testamos enzimas AK resistentes ao feedback de vários organismos que podem ser expressas no desenvolvimento de sementes de soja. Primeiramente, purificamos e caracterizamos bioquimicamente a AK da bactéria entérica Xenorhabdus bovienii (Xb). Mutagênese sítio-dirigida de XbAK identificou dois principais resíduos reguladores, Glu-257 e Thr-359, envolvidos na inibição da lisina. Experiências de inibição de feedback de produto final demonstraram que a substituição conservadora de XbAK Thr-359 com Ile aumentou o valor de IC50 para Lys em 104 vezes, mas nenhuma diferença substancial foi observada em outros parâmetros cinéticos, com exceção de um valor mais baixo de KmATP comparado a a enzima do tipo selvagem (Tabela 1). A mutao do Glu-257 conservado para Lys tamb torna a enzima insensel a Lys, como mostrado por um aumento de 86 vezes no valor de IC50 em comparao com a enzima do tipo selvagem. Os resultados indicam que um papel importante para a artrite ajuda os resíduos Rimadyl, ambos Thr-359 e Glu-257, na inibição por feedback da atividade enzimática.

Para testar a capacidade de variantes AK insensíveis ao feedback para aumentar a acumulação de Thr em sementes de culturas, os alelos XbAK-T359I e XbAK-E257K resistentes a Lys foram expressos em sementes de soja sob o controlo de dois promotores específicos de sementes diferentes. ‘ou USP997 (Tabela 2). Uma sequcia de direccionamento de cloroplasto, CTP1, foi fundida em enquadramento sequcias de codificao AK para direccionar a protea para os plastos, onde a via de aspartato funciona.

Aminoácidos livres de sementes de soja maduras de eventos transgênicos expressando os genes XbAK de tipo selvagem e insensíveis a Lys foram extraídos e quantificados usando um método de HPLC7. Os níveis de Thr ligado à proteína e outros EAAs não foram medidos neste estudo, mas seria útil para ser determinado em futuras linhas transgênicas homozigotas de mãos de osteoartrite. Para cada evento transgênico independente, 25 sementes de R1 (segregando 1: 2: 1, nula: hemizigótica: homozigótica, com respeito ao transgene) foram colhidas na maturidade e aumentadas para análise de aminoácidos livres. Como mostrado na Tabela 2, todas as três construções que expressam variantes resistentes ao feedback mostraram aumentos substanciais nos níveis de Thr livre em comparação ao controle não-transgênico do tipo selvagem, com um aumento de até 100 vezes para a semente do evento mais alto (3112 ppm em USP99 :: CTP1 :: XbAK-T359I vs. 31 ppm em WT). O n�el m�imo de Thr livre nos eventos transg�icos das tr� constru�es que expressam XbAK insens�el a lisina foi 49 a 93 vezes superior ao controlo de tipo selvagem. A express do XbAK de tipo selvagem sensel a Lys n resultou em qualquer alterao substancial nos neis de Thr na semente madura. Os resultados sugerem que a inibição do feedback alostérico da enzima AK pode anular a superexpressão dessas proteínas e desempenha um papel crítico nos laboratórios de artrite no controle da produção de treonina através da via da família do aspartato.

Uma anise adicional dos dados de perfil de aminoidos livres revela que para al dos neis de Thr, foram tamb observados aumentos semelhantes noutros aminoidos derivados de aspartato na semente transgica de XbAK (Tabela 3). Por exemplo, as mudanças nos eventos transgênicos XbAK-T359I orientadas à USP99 incluíram aumentos significativos de metionina (3,9 vezes), lisina (2,6 vezes), isoleucina (3 vezes), glicina (6 vezes) e serina (31). -dobra). Aumentos substanciais no acúmulo de Gly e Ser livres nas sementes de soja transgênica sugerem que o acúmulo de níveis de Thr livres é controlado não apenas pela taxa de sua síntese, mas também pela taxa de conversão para outros aminoácidos.

Sementes de soja com treonina alta expressando XbAK-T359I ou E257K exibem morfologia normal de sementes na aparência e germinação e crescimento de plântulas em casa de vegetação7. Estes resultados sugerem que a alta semente de Tr, que expressa o XbAK insensível à Lys, não tem efeito deletério pleiotrópico no desempenho agronômico da soja.

Aqui relatamos uma estratégia bem-sucedida para produzir sementes de soja com alta concentração de treonina, com morfologia e germinação normais, via expressão de variantes XbAK resistentes ao feedback no desenvolvimento de sementes de soja. A estratégia tem como alvo a enzima AK alostericamente regulada da via do aspartato que controla o fluxo metabólico em treonina, lisina, metionina e isoleucina. A semente de soja High Thr expressando variantes de XbAK insensíveis a Lys também mostra um acúmulo substancialmente maior de outros aminoácidos de definição de espondiloartrite essenciais, incluindo Lys, Met e Ile. A disponibilidade de soja para farelo de soja com alto teor de Tr poderia ser calculada após o teor total de Thr (livre e ligado a proteína Thr) ser determinado nas sementes transgênicas.

Além de aprovar avaliações de segurança, para serem variedades de culturas comercialmente úteis, as características de melhor qualidade de sementes também devem possuir boas características agronômicas em condições de campo. Portanto, para sementes de soja com treonina alta, outras características agronômicas como suscetibilidade a pragas, adaptação ao ambiente, composição de nutrientes e herdabilidade da característica devem ser rigorosamente avaliadas em experimentos de campo antes que a semente de soja nutricionalmente melhorada expressando a variante XbAK possa ser comercializada.

Existem diretrizes de tratamento de espondiloartrites extensas pesquisas no desenvolvimento de variedades de culturas comerciais biotecnológicas com melhor qualidade nutricional de sementes 3, 6, 8, 9. Parece haver pouca dúvida de que podemos vislumbrar o uso de culturas geneticamente modificadas para ajudar a atender às crescentes necessidades nutricionais. de gado e seres humanos. O sucesso com o milho de alta Lys3 e a soja de alta intensidade7 fornece uma base otimista para o desenvolvimento de uma ampla variedade de culturas biotecnológicas eficientes com perfis de EAA específicos. Estas culturas altamente nutritivas, indubitavelmente, levarão a novos desenvolvimentos nas indústrias de alimentos e rações agrícolas.